Nova abordagem mais que dobra a eficiência de edição de células-tronco – ScienceDaily

Uma equipe de pesquisadores interdisciplinares liderada pela Penn State desenvolveu técnicas para melhorar a eficiência do CRISPR-Cas9, a técnica de edição do genoma que rendeu o Prêmio Nobel em 2020. métodos, de acordo com o líder do projeto Xiaojun “Lance” Lian, professor associado de engenharia biomédica e biologia na Penn State, a tecnologia tem limitações – especialmente em aplicações para melhorar a saúde humana.

Os pesquisadores desenvolveram um processo mais eficiente e acessível para aplicar sistemas CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), derivadas de linhagens de células-tronco aprovadas pelo governo federal, que Lian disse que poderia avançar muito no diagnóstico e tratamento de doenças genéticas. A abordagem foi publicada em 7 de setembro em Métodos de Relatórios de Células.

CRISPR-Cas9, que significa repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas e proteína 9 associada a CRISPR, oferece aos cientistas a capacidade de direcionar locais precisos de código genético para alterar o DNA, oferecendo oportunidades para criar novas ferramentas de diagnóstico e mutações potencialmente corretas para tratar causas genéticas de doença.

“O genoma humano é enorme e o CRISPR-Cas9 torna possível aos cientistas encontrar e direcionar um gene mutante com o objetivo de estudá-lo”, disse Lian.

O CRISPR usa um disco de material genético, conhecido como DNA plasmidial, para fornecer ácido ribonucleico (RNA) guiado que posiciona a enzima Cas9 no local preciso do gene alvo. Quando o DNA é localizado, Cas9 se liga a ele e o corta, permitindo que outro DNA repare o corte. Os pesquisadores podem então ver como a remoção altera a expressão do gene. Mas há problemas de eficiência de entrega e edição com os atuais métodos CRISPR baseados em DNA, de acordo com Lian.

“A entrega de efetores de DNA CRISPR é baixa”, disse ele. “Apenas 20% a 30% das células-alvo receberão DNA de edição genética ao usar CRISPR. A entrega de RNA nas células pode ser mais eficiente; no entanto, quando o RNA regular é introduzido, as células podem vê-lo como um vírus. Eles destroem o O RNA antes que ele possa produzir proteínas – digamos, em questão de algumas horas – e, ao fazê-lo, destruir a tentativa de edição do gene”.

Para melhorar o resultado, os pesquisadores mudaram a forma como as ferramentas de edição do genoma são entregues às células-tronco, usando RNA modificado (modRNA). O modRNA difere do DNA plasmidial porque substitui um dos substratos básicos encontrados no RNA por uma versão quimicamente modificada e é estabilizado por um suporte estrutural mais forte.

“O modRNA foi notavelmente mais eficiente do que o DNA plasmidial”, disse Lian. “Cerca de 90% das células receberam o modRNA de uma simples transfecção, por isso foi capaz de permanecer no local e fazer seu trabalho”.

Os pesquisadores também descobriram que a quantidade de tempo em que o modRNA estava no local era ideal: o tempo suficiente para modificar as células, mas não tanto que causasse atividade fora do alvo. Mas o modRNA introduziu outro problema, de acordo com Lian.

Quando o modRNA Cas9 é entregue com sucesso ao gene alvo, ele cria uma quebra de fita dupla no genoma, que algumas células tentarão consertar. Os que se consertam podem passar o reparo, ou “mutação”, para sua progênie. Este é o processo que os pesquisadores querem entender melhor, então essas são as células que eles querem colher e estudar. A questão, disse Lian, é que a maioria das células com essa falha a identifica como um grande problema com o genoma e se autodestruirá em vez de tentar se reparar.

Para reduzir os efeitos colaterais tóxicos do Cas9 e ajudar as células editadas a sobreviver, a equipe de Lian introduziu uma pequena proteína conhecida por ajudar as células a crescer. De acordo com Lian, essa proteína adicionada inibiu a morte celular e melhorou a eficiência de edição de Cas9 em até 84%.

Os pesquisadores também descobriram que o modRNA poderia melhorar outras técnicas de edição de genes, como a edição de base. A edição de base pode eliminar genes ou corrigir mutações no genoma usando uma proteína para alterar um único nucleotídeo em vez de cortar as duas cadeias, como faz o CRISPR.

“Transfectamos células-tronco com uma proteína de edição de base baseada em plasmídeo ou baseada em modRNA”, disse Lian. “Nosso método baseado em modRNA foi mais de quatro vezes mais eficiente, em 68%, do que a técnica baseada em plasmídeo, em cerca de 16%, na edição do genoma com sucesso”.

De acordo com Lian, à medida que mais laboratórios de edição de genes melhoram a eficiência e a eficácia da edição de genes, os pesquisadores poderão entender melhor os genes e suas funções mais rapidamente.

“O corpo humano tem mais de 20.000 genes, mas estudamos as funções de apenas cerca de 10% deles”, disse Lian. “Examinar o propósito de cada gene restante, um de cada vez, pode levar uma vida inteira. Usar células-tronco modificadas de nossas técnicas de edição de genes altamente eficientes pode acelerar bastante esse processo.”

O professor Jian Yang e os estudantes de doutorado Tahir Haideri, Alessandro Howells e Yuqian Jiang, todos do Departamento de Engenharia Biomédica da Penn State, bem como Xiaoping Bao da Purdue University, contribuíram para este trabalho. Lian e Yang são afiliados aos Huck Institutes of the Life Sciences. Lian também é afiliado ao Departamento de Biologia da Penn State.

A National Science Foundation, os Institutos Nacionais de Saúde e Penn State apoiaram este trabalho.

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