Pesquisadores da Universidade de Toronto criaram uma tecnologia de edição de genoma que permite pequenas variações no DNA alvo, mas mantém a especificidade local, e que pode ajudar a realizar o potencial da terapia genética baseada em CRISPR/Cas e no diagnóstico de patógenos.
Os cientistas programam os atuais sistemas CRISPR/Cas para reconhecer e cortar sequências precisas de DNA, para evitar efeitos como cortar a sequência errada ou encorajar mutações indesejadas. Mas essa especificidade torna difícil para os sistemas identificar variantes comuns de uma determinada sequência de DNA, o que limitou parcialmente sua aplicação.
“Muito trabalho foi feito para tornar os sistemas CRISPR/Cas mais específicos”, disse Basil Hubbard, investigador principal da pesquisa e professor associado de farmacologia e toxicologia na Faculdade de Medicina da U of T’s Temerty. “Mas, para certas aplicações, há também a necessidade de direcionamento mais flexível nesses sistemas, e nosso estudo mostra uma maneira possível de atender a essa necessidade.”
O jornal Natureza Comunicações publicou os resultados recentemente.
Os sistemas CRISPR-Cas contêm duas moléculas principais: um RNA-guia CRISPR, que contém pares de bases de nucleotídeos (adenina, citosina, guanina e timina em várias combinações) que guiam o sistema para um trecho complementar de DNA; e uma enzima Cas que corta o DNA para permitir a manipulação de outro código genético.
A nova abordagem substitui bases universais por uma ou mais das quatro bases que compõem os RNAs-guia CRISPR.
“Ele funciona como um asterisco ou curinga em uma pesquisa digital, em áreas onde esperamos variação ou não temos dados”, disse Hubbard. “Com a terapêutica, podemos direcionar variantes comuns do mesmo gene de pessoa para pessoa, como polimorfismos de nucleotídeo único. Para diagnósticos, podemos detectar múltiplas variantes evoluídas do mesmo patógeno.”
As terapias experimentais CRISPR mostraram potencial para eliminar doenças genéticas, incluindo anemia falciforme e distrofia muscular. Mas essas terapias nem sempre funcionam em parte devido a variações genéticas naturais entre os indivíduos, de acordo com alguns estudos.
Hubbard disse que a abordagem de seu grupo poderia ajudar a resolver esse problema, mas que atualmente funciona melhor in vitro e precisaria funcionar mais rápido no ambiente celular, talvez com uma enzima Cas reprojetada.
A tecnologia se mostra mais promissora para aplicação imediata em diagnósticos. O laboratório de Hubbard testou a função do sistema em oito variantes do HIV, cada uma com diferentes resistências aos atuais medicamentos antivirais. Um RNA-guia padrão sem bases universais detectou apenas três das oito variantes, enquanto um sistema com apenas três substituições de bases universais encontrou todas as oito variantes.
“Existe uma enorme diversidade entre patógenos, especialmente vírus e bactérias, e eles evoluem muito rapidamente”, disse Hubbard. “O sistema funciona muito bem para detectar esse tipo de variação e achamos que pode ser útil em condições clínicas”.
Hubbard concebeu a ideia de usar bases universais enquanto trabalhava para tornar os sistemas CRISPR/Cas mais específicos. Seu laboratório, então baseado na Universidade de Alberta, mostrou que a inserção de ácidos nucleicos sintéticos ou ‘xeno’ em RNAs-guia poderia reduzir drasticamente a edição de genes fora do alvo com CRISPR/Cas9.
Efeitos fora do alvo que cortam um gene incorreto podem ter consequências prejudiciais para a saúde de um paciente, incluindo o desenvolvimento de cânceres.
“Nosso estudo atual nos dá mais opções para adaptar a especificidade do CRISPR”, disse Hubbard, que mudou seu laboratório para a U of T no outono passado. “É importante ressaltar que a especificidade desse sistema é interrompida apenas na região onde incorporamos bases universais e é preservada em outras áreas da sequência, mantendo assim os efeitos fora do alvo no mínimo.”
O laboratório de Hubbard registrou uma patente sobre a tecnologia e está procurando uma parceria com uma empresa especializada em diagnóstico CRISPR. Ele espera que o sistema ajude a fornecer uma maneira rápida, precisa e econômica de diagnosticar várias doenças, incluindo o COVID-19.