Usando uma abordagem baseada em proteínas CRISPR, os pesquisadores do MIT desenvolveram uma nova maneira de controlar com precisão a quantidade de uma determinada proteína que é produzida em células de mamíferos.
Esta técnica pode ser usada para ajustar a produção de proteínas úteis, como os anticorpos monoclonais usados para tratar o câncer e outras doenças, ou outros aspectos do comportamento celular. Em seu novo estudo, que aparece em Natureza Comunicaçõesos pesquisadores mostraram que esse sistema pode funcionar em uma variedade de células de mamíferos, com resultados muito consistentes.
“É um sistema altamente previsível que podemos projetar antecipadamente e obter o resultado esperado”, diz William CW Chen, ex-cientista de pesquisa do MIT. “É um sistema muito ajustável e adequado para diversas aplicações biomédicas em diferentes tipos de células.”
Chen, que agora é professor assistente de ciências biomédicas na Universidade de Dakota do Sul, é um dos principais autores do novo estudo, juntamente com o ex-cientista de pesquisa do MIT Leonid Gaidukov e o pós-doutorado Yong Lai. O autor sênior Timothy Lu liderou a pesquisa como professor associado do MIT de engenharia biológica e de engenharia elétrica e ciência da computação.
controle genético
Muitas proteínas terapêuticas, incluindo anticorpos monoclonais, são produzidas em grandes biorreatores contendo células de mamíferos que são manipuladas para gerar a proteína desejada. Vários anos atrás, pesquisadores do Centro de Biologia Sintética do MIT, incluindo o laboratório de Lu, começaram a trabalhar com a Pfizer Inc. em um projeto para desenvolver ferramentas de biologia sintética que poderiam ser usadas para aumentar a produção dessas proteínas úteis.
Para fazer isso, os pesquisadores visaram os promotores dos genes que desejavam regular positivamente. Em todas as células de mamíferos, os genes têm uma região promotora que se liga a fatores de transcrição – proteínas que iniciam a transcrição do gene em RNA mensageiro.
Em trabalhos anteriores, os cientistas projetaram fatores de transcrição sintéticos, incluindo proteínas chamadas dedos de zinco, para ajudar a ativar os genes-alvo. No entanto, os dedos de zinco e a maioria dos outros tipos de fatores de transcrição sintéticos precisam ser redesenhados para cada gene que visam, tornando-os desafiadores e demorados para serem desenvolvidos.
Em 2013, os pesquisadores do laboratório de Lu desenvolveram um fator de transcrição baseado em CRISPR que lhes permitiu controlar mais facilmente a transcrição de genes que ocorrem naturalmente em células de mamíferos e leveduras. No novo estudo, os pesquisadores decidiram desenvolver esse trabalho para criar uma biblioteca de partes biológicas sintéticas que lhes permitiria entregar um transgene – um gene normalmente não expresso pela célula – e controlar com precisão sua expressão.
“A ideia é ter um sistema promotor sintético de espectro completo que pode ir de muito baixo a muito alto, para acomodar diferentes aplicações celulares”, diz Chen.
O sistema que os pesquisadores projetaram inclui vários componentes. Um é o gene a ser transcrito, juntamente com uma sequência “operadora”, que consiste em uma série de sítios artificiais de ligação ao fator de transcrição. Outro componente é um RNA guia que se liga a essas sequências operadoras. Por fim, o sistema também inclui um domínio de ativação de transcrição ligado a uma proteína Cas9 desativada. Quando essa proteína Cas9 desativada se liga ao RNA guia no local do promotor sintético, o fator de transcrição baseado em CRISPR pode ativar a expressão gênica.
Os sítios promotores usados para este sistema sintético foram projetados para serem distintos dos sítios promotores de ocorrência natural, de modo que o sistema não afete os genes nos genomas das próprias células. Cada operador inclui entre duas e 16 cópias do local de ligação do RNA guia, e os pesquisadores descobriram que seu sistema pode iniciar a transcrição do gene em taxas que correspondem linearmente ao número de locais de ligação, permitindo controlar com precisão a quantidade de proteína produzida.
alta consistência
Os pesquisadores testaram seu sistema em vários tipos de células de mamíferos, incluindo células de ovário de hamster chinês (CHO), que são comumente usadas para produzir proteínas terapêuticas em biorreatores industriais. Eles encontraram resultados muito semelhantes em células CHO e nas outras células que testaram, incluindo mioblastos de camundongos e ratos (precursores de células musculares), células renais embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos.
“O sistema tem consistência muito alta em diferentes tipos de células e diferentes genes-alvo”, diz Chen. “Este é um bom ponto de partida para pensar sobre a regulação da expressão gênica e do comportamento celular com um sistema artificial altamente ajustável e previsível”.
Depois de demonstrar pela primeira vez que eles poderiam usar o novo sistema para induzir as células a produzir quantidades esperadas de proteínas fluorescentes, os pesquisadores mostraram que também poderiam usá-lo para programar a produção dos dois principais segmentos de um anticorpo monoclonal conhecido como JUG444.
Os pesquisadores também programaram células CHO para produzir diferentes quantidades de um anticorpo humano chamado anti-PD1. Quando as células T humanas foram expostas a essas células, elas se tornaram matadoras de células tumorais mais potentes se houvesse uma quantidade maior do anticorpo produzido.
Embora os pesquisadores tenham conseguido obter um alto rendimento dos anticorpos desejados, mais trabalhos seriam necessários para incorporar esse sistema aos processos industriais, dizem eles. Ao contrário das células utilizadas em biorreatores industriais, as células utilizadas neste estudo foram cultivadas em uma superfície plana, em vez de uma suspensão líquida.
“Este é um sistema que promete ser usado em aplicações industriais, mas primeiro temos que adaptá-lo em células suspensas, para ver se elas produzem as proteínas da mesma maneira. Desconfio que deve ser o mesmo, porque não há razão não deveria, mas ainda precisamos testá-lo”, diz Chen.
A pesquisa foi financiada pelo Programa de Biologia Sintética Pfizer-MIT RCA, National Science Foundation, National Institutes of Health, University of South Dakota Sanford School of Medicine, uma bolsa de pós-doutorado NIH Ruth L. Kirschstein NRSA e o Departamento de Defesa.