Um mililitro de sangue contém cerca de 15 gotas individuais. Para uma pessoa com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), cada gota de sangue pode conter de menos de 20 cópias do vírus a mais de 500.000 cópias. Chamado de carga viral, é o que é medido para permitir que os médicos entendam como os pacientes estão respondendo aos medicamentos antivirais e monitorem a possível progressão.
O demorado teste de carga viral precisa ser repetido várias vezes durante o tratamento do paciente. Agora, uma equipe de pesquisa da Penn State desenvolveu um ensaio digital econômico e de tempo que pode medir diretamente a presença do HIV em uma única gota de sangue. Eles publicaram o trabalho em ACS Nano.
De acordo com o autor correspondente Weihua Guan, professor associado de engenharia elétrica e engenharia biomédica no Penn State College of Engineering, o ensaio digital é o primeiro passo para fornecer uma ferramenta de diagnóstico clínico para um bando de doenças infecciosas.
Os testes convencionais para carga viral do HIV envolvem a coleta de material genético da amostra, amplificando-o e comparando-o com amostras de referência. O teste padrão-ouro, chamado RT-PCR, pode produzir uma estimativa aproximada da carga viral real, mas não é uma medição direta. Guan e sua equipe adotaram uma abordagem mais direta com seu teste, chamado Autodigitalização por particionamento automatizado baseado em membrana (STAMP), que é mais barato, mais rápido e requer menos sangue do que o RT-PCR.
“É assim que funciona: pegamos uma pequena amostra do sangue de uma pessoa e extraímos o RNA viral – o material genético do vírus – dela”, disse Guan. “Em seguida, misturamos esse RNA com uma proteína especial chamada Cas13, que faz parte do sistema CRISPR”.
CRISPR-Cas13 é uma “ferramenta revolucionária”, disse Guan, que permite aos pesquisadores direcionar e manipular sequências de RNA. Neste estudo, os pesquisadores estão aproveitando a tecnologia não por seus recursos de edição, mas por seu potencial de diagnóstico. Eles estão usando CRISPR-Cas13 para detectar e sinalizar a presença do HIV.
Uma vez que o RNA é combinado com Cas13, os pesquisadores colocam uma membrana de policarbonato de nanoporos – um filtro fino que está prontamente disponível, tornando-o um material econômico, disse Guan – na mistura. Os nanoporos são tão pequenos que podem dividir a mistura em gotículas únicas contendo apenas uma molécula de RNA, que possui a proteína Cas13 ligada. Se o HIV estiver na molécula de RNA, a proteína Cas13 – que é ativada pelo RNA do HIV – cortará as moléculas de relatório, gerando um sinal que os pesquisadores podem detectar.
“Ao contar o número de gotículas que mostram esse sinal, podemos determinar a quantidade de HIV no sangue da pessoa”, disse Guan. “Quanto mais gotículas com o sinal, maior a carga viral.”
Os pesquisadores testaram essa abordagem com RNA do HIV sintético para otimizar o ensaio quanto à sensibilidade e precisão antes de testar o plasma de laboratório e, eventualmente, amostras de plasma de pacientes. Eles validaram o método STAMP quantificando as cargas virais do HIV em amostras de plasma de 20 pacientes com precisão comparável ao método tradicional de RT-PCR, que normalmente requer mais sangue. Guan disse que está trabalhando na obtenção de mais amostras para continuar seus testes.
A equipe também descobriu que a abordagem pode fornecer uma avaliação precisa para cargas virais de HIV iguais ou superiores a cerca de 2.000 cópias de vírus por mililitro de sangue. Uma carga viral é considerada baixa quando há menos de 10.000 cópias do vírus por mililitro; indetectável em 20 cópias ou menos; e alto em cerca de 100.000 cópias, mas pode se estender além de um milhão.
De acordo com Guan, a faixa de detecção de 2.000 a 10.000 pode ser importante para os médicos que monitoram os pacientes quanto ao rebote viral. As pessoas submetidas à terapia antirretroviral (TARV) podem atingir níveis de vírus indetectáveis, o que significa que não podem mais transmitir o vírus sexualmente, mas o aumento dos níveis de vírus pode indicar que um indivíduo está desenvolvendo resistência à TARV ou outro problema.
“Embora sejam necessárias mais melhorias para aumentar seu limite de detecção e automatizar a configuração, o método CRISPR digital baseado em STAMP mostra grande potencial para o avanço do monitoramento da carga viral do HIV”, disse Guan, explicando que os pesquisadores planejam continuar melhorando a eficiência e a precisão da plataforma. para quantificar vários vírus, com o objetivo final de trazer o dispositivo para o mercado.
Os co-autores incluem Reza Nouri e Tianyi Li, ambos estudantes de pós-graduação em engenharia elétrica; Yuqian Jiang e Anthony J. Politza, ambos estudantes de pós-graduação em engenharia biomédica; Wallace H. Greene, professor associado emérito, e Yusheng Zhu, professor, ambos do Departamento de Patologia, Penn State College of Medicine; Jonathan J. Nunez, professor assistente do Departamento de Medicina da Penn State College of Medicine e médico de medicina interna do Penn State Health Milton S. Hershey Medical Center; e Xiaojun Lian, professor associado de engenharia biomédica e de biologia que também é afiliado ao Huck Institutes of Life Sciences.
Os Institutos Nacionais de Saúde e a Fundação Nacional de Ciência apoiaram este trabalho.