Pesquisadores da Rice University demonstraram que o CRISPR-Cas9, cada vez mais famoso como uma ferramenta de edição de genes, pode ser empregado de maneiras adicionais poderosas em células humanas.
Uma equipe liderada pelo bioengenheiro de Rice Isaac Hilton e pelo estudante de pós-graduação Kaiyuan Wang usou proteínas Cas9 (dCas9) desativadas para atingir segmentos-chave do genoma humano e desencadear sinteticamente a transcrição de genes humanos.
Usando dCas9 para recrutar proteínas que podem ativar genes naturalmente, a equipe de Rice foi capaz de revelar detalhes importantes sobre promotores e intensificadores humanos – os pedaços de nosso DNA que coordenam quando e até que ponto nossos genes são ativados – que por sua vez controla o comportamento de nossas células.
“Estamos usando essas ferramentas de biologia sintética para melhorar a capacidade de projetar a expressão gênica e programar células humanas e, consequentemente, entender melhor como nossos genes funcionam naturalmente”, disse Hilton. “Esses tipos de estudos são importantes porque, a longo prazo, esse conhecimento e essas capacidades técnicas podem permitir melhores terapias genéticas e celulares e biotecnologias”.
Hilton disse que o estudo da Nucleic Acids Research destaca o crescente potencial das ferramentas baseadas em CRISPR-Cas9 para controle de genes sintéticos e engenharia celular. A estratégia da equipe também demonstra o poder do dCas9 para influenciar e compreender os fatores epigenéticos que animam o genoma humano.
“Apenas cerca de 2% do nosso genoma contém genes que codificam proteínas, e os 98% restantes são o chamado DNA não-codificante”, disse Hilton. “Amplificadores e promotores são partes essenciais de nossos genomas não codificantes e, embora a grande maioria desses elementos não produza genes convencionais, há uma variação genética fascinante no DNA não codificante. Essa variação nos dá a magnífica diversidade que permite que nossa espécie seja incrível e adaptável.
“No entanto, a variação genética no DNA não codificante também está fortemente correlacionada com muitas doenças, e mesmo diferenças sutis nessas regiões podem estar ligadas a patologias”, disse ele. “Um desafio premente é que muitas vezes é muito difícil identificar como essas diferenças influenciam o início da doença e os tratamentos.
“Nosso objetivo e nossa esperança é que tecnologias e abordagens como a nossa possam ajudar os pesquisadores a se aproximarem de fazer essas conexões importantes e, em última instância, prever e intervir de maneira cuidadosa nas doenças”, disse Hilton.
Ao ativar sinteticamente o DNA não codificante, os pesquisadores demonstraram como os promotores – sequências curtas de DNA que marcam os locais de início dos genes – e os intensificadores podem se comunicar. Notavelmente, os intensificadores podem estar a milhares de pares de bases de distância de seus promotores, mas podem estimular a transcrição gênica recrutando proteínas ativadoras e formando contatos físicos diretos com promotores associados.
“Enhacers também podem, às vezes, fazer transcrições misteriosas chamadas de RNAs intensificadores (eRNAs)”, disse Hilton. “Kai mostrou que as tecnologias CRISPR podem ser usadas para ativar esses eRNAs e, em alguns casos, isso promove um tipo de rastreamento genômico, no qual um intensificador pode ser arrastado ao longo do DNA para se envolver com os promotores a jusante.
“Parece também que, ao longo do caminho, informações transcricionais e epigenéticas vitais podem ser depositadas”, disse ele. “É emocionante especular que esta informação poderia servir como uma espécie de marcador de expressão gênica que reforça as rodadas subsequentes de transcrição em um tipo de feedback epigenético positivo”.
Sua estratégia revelou que intensificadores e promotores podem ter “reciprocidade intrínseca”. Embora soubessem que os sinais podem ser transmitidos de um intensificador para um promotor, eles aprenderam que essa transmissão também pode ocorrer de outra forma.
“Vemos a regulamentação ocorrendo de um promotor para um intensificador upstream”, disse Wang. “Mecanicamente, isso é considerado não canônico e, portanto, bastante surpreendente.”
Eles também descobriram que os ativadores CRISPR podem aumentar a frequência de contatos físicos entre intensificadores e promotores, mas apenas quando direcionados a um intensificador, sugerindo uma espécie de via de mão única para aumentar os contatos físicos.
“Agora sabemos que esses pedaços de DNA podem enviar mensagens em ambas as direções, mas parece haver um aspecto significativo de direcionalidade para contato físico”, disse Hilton. “Certamente existe reciprocidade, mas parece que o modo regulatório predominante aqui é aquele em que um intensificador segue em direção a um promotor ou promotores correspondentes”.
Os pesquisadores disseram que seu estudo só é possível por causa dos avanços do CRISPR-Cas9. “Sem essas ferramentas de direcionamento genômico, teríamos que usar outros métodos sintéticos mais invasivos e disruptivos, como nocautear ou modificar geneticamente um elemento regulatório”, disse Wang. “Nossas abordagens aqui tornam mais fácil sequestrar epigeneticamente ou redirecionar mecanismos celulares nativos para entender e projetar com precisão como os genes são controlados”.
Os co-autores do artigo incluem os pesquisadores de pós-doutorado de Rice, Jing Li e Barun Mahata, os alunos de pós-graduação Mario Escobar e Jacob Goell e os alunos de graduação Spencer Shah e Madeleine Cluck. Hilton é professor assistente de bioengenharia e biociências e CPRIT Scholar in Cancer Research.
O Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (RR170030) e os Institutos Nacionais de Saúde (R35GM143532) apoiaram a pesquisa.