Um laboratório da Rice University está liderando o esforço para revelar possíveis ameaças à eficácia e segurança das terapias baseadas em CRISPR-Cas9, a técnica de edição de genes vencedora do Prêmio Nobel, mesmo quando parece estar funcionando conforme o planejado.
O bioengenheiro Gang Bao, da Escola de Engenharia George R. Brown de Rice, e sua equipe apontam em um artigo publicado na Science Advances que, embora as edições fora do alvo no DNA tenham sido motivo de preocupação, as mudanças invisíveis que acompanham as edições no alvo também precisam para ser reconhecido – e quantificado.
Bao observou que um artigo da Nature Biotechnology de 2018 indicou a presença de grandes deleções. “Foi quando começamos a investigar o que podemos fazer para quantificá-los, devido aos sistemas CRISPR-Cas9 projetados para o tratamento da doença falciforme”, disse ele.
Bao tem sido um forte defensor do CRISPR-Cas9 como uma ferramenta para tratar a doença falciforme, uma busca que trouxe ele e seus colegas cada vez mais perto de uma cura. Agora, os pesquisadores temem que grandes deleções ou outras alterações não detectadas devido à edição de genes possam persistir nas células-tronco à medida que se dividem e se diferenciam, tendo, portanto, implicações de longo prazo para a saúde.
“Não temos uma boa compreensão de por que alguns milhares de bases de DNA no local de corte Cas9 podem desaparecer e as quebras de fita dupla do DNA ainda podem ser reunidas com eficiência”, disse Bao. “Essa é a primeira pergunta, e temos algumas hipóteses. A segunda é, quais são as consequências biológicas? Grandes deleções (LDs) podem atingir genes próximos e interromper a expressão tanto do gene alvo quanto dos genes próximos. Não está claro se LDs podem resultar na expressão de proteínas truncadas.
“Você também pode ter proteínas que se dobram incorretamente ou proteínas com um domínio extra por causa de grandes inserções”, disse ele. “Todos os tipos de coisas podem acontecer e as células podem morrer ou ter funções anormais”.
Seu laboratório desenvolveu um procedimento que usa sequenciamento de molécula única em tempo real (SMRT) com identificadores moleculares únicos duplos (UMI) para encontrar e quantificar LDs não intencionais junto com grandes inserções e rearranjos cromossômicos locais que acompanham pequenas inserções/exclusões (INDELs) em um local de corte no alvo Cas9.
“Para quantificar grandes modificações genéticas, precisamos realizar PCR de longo alcance, mas isso pode induzir artefatos durante a amplificação do DNA”, disse Bao. “Portanto, usamos UMIs de 18 bases como uma espécie de código de barras.”
“Nós os adicionamos às moléculas de DNA que queremos amplificar para identificar moléculas específicas de DNA como forma de reduzir ou eliminar artefatos devido à PCR de longo alcance”, disse ele. “Também desenvolvemos um pipeline de bioinformática para analisar dados de sequenciamento SMRT e quantificamos os LDs e grandes inserções”.
A ferramenta do laboratório Bao, chamada LongAmp-seq (para sequenciamento de amplicon longo), quantifica com precisão tanto os pequenos INDELs quanto os grandes LDs. Ao contrário do SMRT-seq, que requer o uso de um sequenciador de leitura longa, geralmente disponível apenas em uma instalação principal, o LongAmp-seq pode ser executado usando um sequenciador de leitura curta.
Para testar a estratégia, a equipe de laboratório liderada pela ex-aluna de Rice, Julie Park, agora professora assistente de pesquisa em bioengenharia, usou Streptococcus pyogenes Cas9 para editar beta-globina (HBB), gama-globina (HBG) e linfoma/leucemia de células B 11A (BCL11A) em células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) de pacientes com doença falciforme e o gene PD-1 em células T primárias.
Eles descobriram que grandes deleções de até vários milhares de bases ocorreram em alta frequência em HSPCs: até 35,4% em HBB, 14,3% em HBG e 15,2% em genes BCL11A, bem como no gene PD-1 (15,2%) em T -células.
Como dois dos RNAs-guia CRISPR específicos testados pelo laboratório Bao estão sendo usados em ensaios clínicos para tratar a doença falciforme, ele disse que é importante determinar as consequências biológicas de grandes modificações genéticas devido a quebras de fita dupla induzidas por Cas9.
Bao disse que a equipe de Rice está atualmente analisando as consequências de longas deleções no RNA mensageiro, o mediador que carrega o código dos ribossomos para produzir proteínas. “Então vamos passar para o nível de proteína”, disse Bao. “Queremos saber se essas grandes deleções e inserções persistem depois que os HSPCs editados por genes são transplantados para camundongos e pacientes”
Os co-autores do estudo de Rice são os estudantes de pós-graduação Mingming Cao e Yilei Fu, os ex-alunos Yidan Pan e Timothy Davis, a especialista em pesquisa Lavanya Saxena, o especialista em microscopista/bioinstrumentação Harshavardhan Deshmukh e Todd Treangen, professor assistente de ciência da computação, e Vivien, da Emory University Sheehan, professor associado de pediatria.
Bao é o chefe do departamento e Foyt Family Professor of Bioengineering, professor de química, ciência de materiais e nanoengenharia e engenharia mecânica, e um CPRIT Scholar em Cancer Research.
Os Institutos Nacionais de Saúde (R01HL152314, OT2HL154977) apoiaram a pesquisa.