Os pesquisadores da LMU desenvolveram um método que permite que as células imunológicas humanas em repouso sejam analisadas geneticamente em detalhes pela primeira vez.
CD4+ As células T são partes importantes do sistema imunológico e desempenham um papel fundamental na defesa do corpo contra patógenos. Como eles possuem uma grande variedade de mecanismos de defesa contra o HIV em seu estado de repouso, eles são infectados apenas muito raramente – mas essas poucas células infectadas formam um reservatório latente para o HIV no corpo que atualmente não pode ser alcançado por drogas antivirais. Consequentemente, o vírus pode se espalhar novamente a partir daí após a ativação do CD4+ células T. Compreender como o HIV interage com o CD4 em repouso+ As células T são essenciais para encontrar novas abordagens terapêuticas. Cientistas liderados pelo Prof. Oliver T. Keppler do Instituto Max von Pettenkofer em LMU desenvolveram agora um método que pela primeira vez permite que essas células imunológicas específicas sejam geneticamente manipuladas sob condições fisiológicas de maneira eficiente e descomplicada. Como relatam os autores na revista Métodos da Naturezaisso permite insights anteriormente impossíveis de obter sobre a biologia dessas células.
CD4 em repouso+ As células T dificilmente eram passíveis de manipulações genéticas, porque os métodos disponíveis geralmente pressupõem células em divisão, como explica Keppler. “E as células em repouso não se dividem por definição.” Como primeiro passo no desenvolvimento do novo método, a equipe de cientistas otimizou as condições de cultivo. Como resultado, os pesquisadores conseguiram manter essas células vivas no laboratório depois de extraí-las do sangue de doadores saudáveis, não apenas por 3 a 4 dias como antes, mas por até seis semanas. O progresso decisivo veio com um avanço na nucleofecção, um método especial que permite que os reagentes sejam entregues no núcleo de uma célula. Usando essa técnica, os pesquisadores introduziram a tesoura genética CRISPR-Cas no CD4 em repouso+ células T, permitindo-lhes fazer modificações direcionadas ao genoma das células hospedeiras – por exemplo, eliminando genes por meio dos chamados nocautes. “Essa combinação funcionou de maneira muito eficiente e conseguimos alcançar e manipular geneticamente cerca de 98% das células. Além disso, fizemos isso sem ativar o CD4+ Células T”, diz Keppler. “O que foi particularmente emocionante foi que fomos capazes de eliminar até seis genes simultaneamente com alta eficiência por meio de uma única nucleofecção. Ninguém havia conseguido fazer isso em células primárias antes – e nós fizemos isso com células isoladas de um órgão intacto”.
No futuro, os pesquisadores serão capazes de eliminar genes individuais e vias de sinalização inteiras e analisar suas funções. Ao nocautear os genes correspondentes, eles já conseguiram esclarecer se quatro fatores celulares anteriormente controversos desempenham um papel na infecção pelo HIV ou não.
Além disso, eles buscaram uma segunda abordagem “knock-in”, na qual genes adicionais ou ligeiramente modificados são inseridos, como um gene para a proteína fluorescente verde (GFP). Com a ajuda dessa proteína, os pesquisadores podem analisar como a atividade de um gene alvo muda sob certas condições ou podem marcar proteínas específicas. “Todas essas coisas juntas nos dão a oportunidade pela primeira vez de investigar a interação do HIV com o CD4 humano em repouso.+ Células T sob condições fisiológicas”, explica Adrian Ruhle, co-autor principal do estudo. “Mas também podemos investigar melhor essas células em seu papel geral como células imunológicas além do HIV”. o melhor entendimento da biologia dessas células levará a novas abordagens para a eliminação total do HIV do corpo dos pacientes, já que ainda existem cerca de 37 milhões de pessoas infectadas pelo vírus no mundo.